双酶切,连接,转化问题,连接不成功还能长这么多的菌?

2016-08-17技术资料

最近做转化,结果很郁闷,跟各位交流一下
我用的载体是一个1300改造后的载体,别人给的,卡那抗性。自己的片段1500bp,是从另一个载体上酶切得到,两端的酶切位点分别是EcoR l 和 Hind lll ,1300载体也用EcoR l 和 Hind lll 酶切后,回收大片段,用Takara 的T4 连接酶 16°C 反应过夜;转化涂板。
现在问题来了,涂平板长的菌都是一片一片的,很难有单菌落。图中是我用了10微升的菌液涂卡那板,结果长成这个样子。我之前做转化从来没有碰到过这种情况,各位虫子有没有什么好的建议?此外,我挑出几个菌斑摇菌,加了卡那抗生素,抽质粒后,再进行双酶切,怎么都得不得2条带,也就是没有我的目的片段,实在是不明白了,连接不成功还能长这么多的菌?哪位高手分析下啊啊啊~

 

抗生素不管用了

 

检查下kan是否失效。

 

强烈建议你换平板,不行的话换感受态

 

换新的感受态,换新的kan,加的时候培养基温度不要太高

 

卡纳重新配  估计就是这个浓度出问题了

 

把感受态找个抗生素平板涂布一下,看看是不是感受态有问题~~~

 

应该是抗生素不好用了
之前我也遇到过这种情况,长了一满板,而且菌落PCR验证也不对
我是做TA克隆,后来换了新的抗生素,外加蓝白筛选,验证成功了

 

可能是感受态染杂菌了

 

我最近涂板也总出现类似的问题,后来把菌液稀释了十倍重新涂,还是这个样,请问你的问题解决了吗?到底是什么原因啊?谢谢


抗生素不管用了
上个月刚配的,这么快就失效了吗?一般抗生素在-20°C 能存放多久?

检查下kan是否失效。
怎么检测呢?用不抗kan的菌试试?

强烈建议你换平板,不行的话换感受态
感受态应该没问题,跟之前的实验用的是同一批

换新的感受态,换新的kan,加的时候培养基温度不要太高
感受态应该是好的,之前也在用。看来是kan的问题了

卡纳重新配  估计就是这个浓度出问题了
嗯,大家都想到了这个问题,我上个月配的,这么快就不管用了吗

把感受态找个抗生素平板涂布一下,看看是不是感受态有问题~~~
感受态之前也在用,应该是好的

应该是抗生素不好用了
之前我也遇到过这种情况,长了一满板,而且菌落PCR验证也不对
我是做TA克隆,后来换了新的抗生素,外加蓝白筛选,验证成功了
嗯,谢谢,我也决定重新配一下看看
 
我最近涂板也总出现类似的问题,后来把菌液稀释了十倍重新涂,还是这个样,请问你的问题解决了吗?到底是什么原因啊?谢谢
目前还没解决。我个人感觉感受态应该没问题,因为之前一直在用。我决定重新配kan试试
 

可能是卡那放久了失效或浓度过低或在倒平板时温度过高,还有可能是感受态被污染了,不过可以先通过你原有的质粒大小判断你提取的质粒大小是否正确。可进一步确定问题的所在

蚊在江湖

像是抗生素失效


嗯,大家都想到了这个问题,我上个月配的,这么快就不管用了吗
抗生素分装好后,最好在-30里面存放,不要放在4度~
现化现用~~
 

污染,抗生素失效,重新准备材料或者多做对照.

染菌可能性比较大了,还有就是抗生素失效了,一般来说,是不会长着的么多的。
第一个可能像大家说的抗生素出问题了,但是不排除你的载体酶切效果不好。比如有部分载体没有切开,或者部分载体是单酶切,在挖胶回收的时候很难分开,这种情况连接转化往往也会导致长满板,而且都是没有目的片段的空载体。
 


原因找到了!感受态有问题。之前用Amp和奇霉素筛选都没问题,我用Kan 筛选总是做不好,原来感受态细胞有kan抗性  所以我就不幸中枪了~
跟别人要了新的感受态,明天信心满满继续奋斗实验~~~
虽然不一一回复了,但还是再次感谢各位!


上个月刚配的,这么快就失效了吗?一般抗生素在-20°C 能存放多久?
我配的放-20一年以上都没有问题的
 

我觉得你应该做个阳性对照和阴性对照,这样能比较好的看出是感觉态的问题还是抗生素的问题,希望你的问题可以尽快解决!


我配的放-20一年以上都没有问题的
嗯 已经验证了是感受态的问题了,谢谢~