为什么Gateway 方法构建载体转化效率太低?

2016-08-17技术资料

本人最近用Gateway 方法构建载体,做到BP反应这一步了,转化大肠杆菌之后做菌液PCR,挑了20几个菌落,没有一个阳性克隆,之前师姐他们都是一次成功的,不是该方法转化效率很高吗?为什么到我这就这么低呀

这么说来,你的转化肯定有问题了。20个都没有,那个就太低了啊 !

是不是BP反应有问题啊,板上长了很多单菌落啊
 
GATEWAY法BP反应效率很高。楼主用于BP反应的PCR产物有多大?大于5 kb至少要室温过夜才能得到理想的结果。
 
2.5Kb,反应了11个小时呢,时间够长啊

我的做法一般是BP反应后,转化TOP10细胞,涂板在加了相应抗生素的平板上,长出菌落后挑单菌落在抗生素培养基中扩培,提质粒酶切测定。

我的是转化DH5α,然后涂板再挑菌做菌液PCR,之前师姐他们都是一次成功的,我的却一个也没有,真不知道问题出在哪了,对了,我的PCR产物凝胶回收之后电泳目的条带上面有拖尾,M也是这样,不知这是否有影响
 
如果M也拖尾,很可能是电泳条件有问题,但如果能在估计的大小切出目的条带,应该就不影响后续工作。能否贴电泳图出来看一下。
你做挑菌液,PCR,引物和条件都与你师姐一样么?

这是凝胶回收之后的电泳图,目的条带的大小正确而且浓度很大

凝胶回收之后的电泳图
 
加入的PCR产物量大,不一定就好。我们一般反应4小时就够了。
酶在使用之前提前几分钟拿出来放在冰上冻融,稍微离心一下,这样会好一些。

我的片段是2.5Kb,反应时间是不是要长一些?
说明书上的反应时间一般推荐为1小时,如果时间太长的话,BP酶本身的活性可能已经丧失了,延长时间也没有必要。
 
我又做了一次仍然没有阳性克隆,愁死了

我又做了一次仍然没有阳性克隆,愁死了
建议你把中间载体的质粒DNA检测一下,是否降解了。浓度调整到100ng/ul左右,取1ul用于反应。并将PCR产物纯化。

我又做了一次仍然没有阳性克隆,愁死了...
楼主后来的BP成功了吗?我最近也是总做不出来,烦死了~
爱笑的大脸猫

敢问楼主用的什么载体?在下要买载体,一片茫然,求回复

我用pDONR221(invitrogen),有不同抗性的版本。
 

我最近做BP反应(pDONR221)也是假阳性巨多,也许空载体37度摇菌扩增时CCDB发生了突变,TOP10转空载体的对照也有个别菌落长出来。
其实,我做BP反应很少有像一些小伙伴说的长成百上千的,貌似片段越大酶连效率越低。
另外,也和感受态效率有关。新鲜感受态效率普遍比冻存一段时间的高。

invitrogen的载体不错,可以直接在Gateway cloning system里面查下。