在过去的几年中,荧光显微镜下迅速增长领域的发展从依赖传统的显微摄影使用乳液型薄膜在电子影像输出选择。成像设备是在荧光显微镜的Zui关键的部件之一,因为它在什么水平标本的荧光可检测的决定,有关结构的解决,和/或一个过程的动态可视化和记录。
光检测方法和目前可用显微镜做出的选择过程中的困难和经常混淆的成像设备的多种的范围。这种讨论的目的是有助于了解光检测的基础知识,并提供指导选择适合特定的应用程序在荧光显微镜探测器。如图1所示,是配备有落射荧光显微镜,一个国家的Zui先进的百万像素数码成像摄像机系统Peltier冷却设计了广泛接触,在低亮度水平范围在24位色图像标本。这种类型的,以及其他的替代方案的探测器在以下各段审查。
探测器表征参数
电子成像传感器的性能可以被描述的变量包括:光谱灵敏度,量子效率,空间分辨率,均匀度,信号/噪声比,动态范围,响应速度。这些规范是在审查数字成像技术中的概念在我们的部分详细讨论,但为方便起见,这里包含一个简短的介绍。光谱灵敏度是指作为入射光波长的函数探测器信号。此参数通常表示的量子效率(QE),衡量一个探测器的能力产生电子电荷,从检测到的事件光子的百分比。通常是由两个高对比度对象之间的歧视所需的Zui小间隔确定的空间分辨率的限制,例如,在黑色背景上的白点或线。对比度是一个重要的决议的因素,因为高对比度的对象(如黑色和白色线条)更容易比低对比度的对象(如相邻的灰线)解决。
更丰富的电子探测器的空间分辨率措施的调制传递函数(MTF)和对比传递函数(CTF),其中展示的空间频率的函数的探测器响应的幅度。周大福是探测器响应,确定了一系列黑色和白色的酒吧,成为逐步收窄,紧密联系起来。每个酒吧的基本上是一个方波,100%的对比度。的MTF是一个表达式,描述一个正弦信号,作为一个空间频率的函数(60%对比正弦波)的对比减少。电子探测器的极限分辨率以上噪声阈值的检测,一个概念,通常被称为极限分辨率的频率,这是空间频率的MTF值3%下降到Zui小的目标尺寸,相应的可见光检测限。
电子探测器的均匀性包括以下几个变量:在传感器的增益变化,无论在噪声和采样效率的地区差异(通常被称为着色),和空间变化的光收集或传输效率。电子探测器相比往往是他们的信号/噪声比(S / N),衡量变化的一个信号,表示信号的幅度可以预计的信心。可见光有一种内在的的随机性质的光子通量,这是信号的平方根等于产生的噪声成分。噪声也来自各种其他来源,如输出放大器(读出噪声),并在电子设备往往可以通过降低工作温度降低。在没有光的情况下产生的电子设备发出的噪音被称为暗电流或暗噪声,这是热敏感,增加检测器温度的函数。
Intrascene动态范围是来自Zui高和Zui低的可同时在相同的视野检测的强度。 Interscene动态范围探测器增益,积分时间,镜头的光圈,或其他变量是不同的领域,角度调整时,可容纳的强度范围。的动态范围和信号/噪声,不应混为一谈。动态范围是经常的Zui大信号,信号与阅读相关的噪音分为可累积计算。电子探测器的响应速度滞后,代表以前的形象,延续到下一个后,在规定的时间间隔已过分数。
电子探测光
常用的光探测器的两个例子,缺乏空间歧视的光电倍增管和光电二极管(如图2所示)。这两款器件采用了感光表面捕获事件光子,并生成检测和放大的电子收费。光电倍增管(光电倍增管)被广泛使用在共聚焦显微镜和高端胶片相机的自动曝光机构以及在光谱仪。这些器件响应时,光子影响上的光阴和解放的电子加速走向一系列dynodes已知的弧形板,组成一个电子倍增。
光进入光电倍增管的输入窗口罢工的光阴,它利用入射光子的能量释放电子,Zui近已提高到约40%(见中图3的GaAsP曲线)的峰值量子效率。光阴活跃的领域范围的大小从几毫米到一个直径半米,取决于应用程序。
从金属通道倍增电极链的输出电流成比例的光子撞击光阴的数量和电压下降沿倍增电极通道。光谱灵敏度取决于光阴的化学成分,Zui好的设备通常采用砷化镓和敏感的紫外线,可见光,和红外光的波长范围从300到850纳米(图3)。光电倍增管光阴极不统一的敏感和较集中的地区之一,通常的光子传播,而在整个入口窗口。由于光电倍增管不存储电荷和回应在几纳秒内的入射光通量的变化,它们可用于检测和记录速度极快的事件。这些设备通常会造成一个巨大的动态范围,电流输出仍准确地反映了光子通量产生的低噪音值(和暗电流)。这些设备所展出的是获得大的增益,在不牺牲带宽,其范围可以从100到1500 MHz的科学级的光电倍增管的比例非常高的信号/噪音。
三个照明波长的函数说明量子效率的电子探测器的光谱灵敏度曲线图3。两个曲线(图3中的曲线较低)产生的光阴成分,利用或者镓砷化物磷化(GA - AS - P)或砷化镓(GA - AS)合金的光电倍增管,而第三个曲线代表一个带有紫外线透明窗口的硅光电二极管的响应。
硅光电二极管也迅速作出反应,轻者产生电流,但他们没有巨大的收益,伴随着由光电倍增管的电子乘法。光电二极管有一个相对平坦的响应,在整个可见光谱与量子效率高,范围从80%到90%(图3)。光敏面的均匀性非常出色,和这些设备的动态范围和响应速度之间的任何光探测器的Zui高。然而,硅二极管,产生大量的噪音,(其中大部分热),在相对较差的信号噪声产生光子有限的条件下下,如常见的是在荧光显微镜。已开发光电二极管把有限的增益(雪崩光电二极管,如图2所示),并已在一些焦和宽视场荧光显微镜利用。虽然他们已经高达300倍的增益,他们表现出显着的暗噪声,即使当冷却到0 ° C
面积探测器
这些设备一般分为两大类:管式和固态探测器。摄像管的摄像机(如图4所示)是一个光敏面是“读出”由扫描电子束管式探测器。在vidicons,光敏面店收费比解放电子,而在光阴。感光捕获的光子会改变其电阻,在其网站的影响和扫描波束的电流产生一个信号,通过这些网站更容易流动。由于摄像管传感器已在很大程度上取代现代固态探测器和历史意义,不仅是因为利益,他们将不会考虑任何进一步的细节。
固态探测器包括一个光电二极管将电荷存储区域的密集矩阵。市售几种不同的基本概念,包括流行的电荷耦合器件(CCD),电荷注入装置(CID)和互补金属氧化物半导体检测器(CMOS)。在每个探测器,一个硅二极管光敏(通常表示一个像素),再加上的电荷存储区域,反过来,连接到放大器,读出积累的电荷的数量。在CID和CMOS探测器,每个单独的光敏有一个与之相关的放大器,从一排放大器的混合信号并行输出。虽然由硅光电探测器的电荷存储技术是相识多年之前,“防治荒漠化公约”的发展,一个适当的机制进行系统读取所需的设备成为现实之前,要制订本储存的电荷。在防治荒漠化公约“,通常只有一个放大器在整个阵列的角落,依次通过并行传输和存储的电荷寄存器线性串行寄存器,然后到毗邻的读出放大器输出节点。
由于CCD是目前使用Zui广泛的荧光显微镜检测器,我们将在更详细地考虑它的性能。在适当情况下将作出区别,这两个类之间的CCD相机:消费级和科学级。重要的是要指出,所有的电子探测器,虽然是模拟设备产生电流或收费,配有内部的数字化仪相机Zui近已经表示,因为他们没有一个模拟信号输出,数码相机。
一些防治荒漠化公约科学应用中使用的相机是在室温下操作,而有些则是冷却降低暗电流(20 ° C的温度降低,减少了十倍的CCD暗电流)。由于电荷存储井不热产生的暗噪声填写在整合期间,长时间曝光是可能的。科学使用冷却相机往往指定慢扫描,因为他们的帧速率是低于标准的视频摄像头。
一个视频速率的摄像头读取所存储的电荷和输出视频领域每16.7毫秒,以符合所建议的标准(RS - 170或??RS - 330表示),其中30个视频帧每秒的生产与每个帧包括两个隔行扫??描场(欧??洲标准格式需要一个字段,每20毫秒,每秒50个领域)。视频利用我们的视觉系统产生图像的速度比临界闪烁频率的速度滞后,其中闪烁的不再是人眼感知的视频刷新频率。获得序列中的每个视频领域,含50%,在整个框架的信息,结果,有16.7毫秒连续奇数或偶数扫描线的完整的图像之间的时间差。如果一个视频速率的摄像头的输出停止,并允许光线落在CCD长时间,前两个视频领域产生包含在整合期间所积累的所有信息。
两个视频领域的交错,以产生一个完整的视频帧是一个聪明的解决工程问题产生的电子和信号的传输和接收组件电视的发展提供带宽的限制。现在高得多的频率放大器及相关电子产品许可证的生产,存储,并在随后显示帧速率,以1000/second无需隔行扫描线。这种逐行扫描摄像机生产从顶部向底部图像的连续扫描。这并不意味着,获得前下方的顶行;相反,设备第一次在整个传感器集成的光子通量,然后迅速取代积累的电荷的电荷存储和传输区域,是进一步照明保护。
常用的两个CCD的设计实现如此迅速的转移:隔行传输CCD和帧转移CCD,这是图表,如图5所示。隔行传输CCD采用电荷转移通道(称为“隔行口罩”,在图5)紧邻每个光电二极管,使积累的电荷可以有效和迅速地转移到渠道之后,图像采集工作已经完成。隔行传输CCD可能会通过改变电压,使产生的电荷注入基板,而不是转移到传输通道光电二极管电子快门。这些器件还包括一个电子的“漏”,以防止晕染,通常与微透镜阵列配备,以提高光电二极管的填充因子和量子效率。
帧转移CCD传感器使用一个由两部分组成,其中并行阵列的一半被用作一个存储区域,是由轻保护,轻紧掩码。允许传入的光子被发现部分落在阵列和积累的电荷,然后迅速转移到蒙面的电荷转移到串行输出寄存器存储区域。当信号被集成传感器对光敏感的部分,所存储的电荷被读出。这种架构的缺点是充电涂抹在“防治荒漠化公约”的蒙面地区转移到光敏感,但这往往能得到补偿。
从一个简单的硅光电探测器光谱灵敏度的CCD不同,因为CCD表面电荷转移的渠道是由多晶硅栅电极屏蔽。这些结构吸收的波长较短,减少设备的蓝色感光度。这里应该指出,40%的峰值量子效率显着低于一个单独的硅光电二极管,一个典型的消费者或科学级CCD的光谱敏感度曲线是说明在图6(标准CCD)。Zui近已增加在蓝绿色的一些科学级的CCD(蓝加曲线图6)的敏感性显着改善,渠道的透明度。由于渠道的损失完全消除背照式CCD。在本设计中,光下降到CCD在已被腐蚀变薄的区域后面,直到它是透明的(厚度约10-15微米)。由此产生的光谱灵敏度曲线,图6所示(背面减薄的CCD),说明此配置可以实现高量子效率。然而,变薄的结果,迄今为止,只有在高端科学级CCD相机雇一个微妙的,相对昂贵的传感器。
一个防治荒漠化公约“的决议是一个光电二极管和他们的相对大小投射影像的数量的功能。 1000 × 1000传感器CCD阵列现在司空见惯的科学级摄像机。在消费者和科学级CCD制造的趋势是传感器的尺寸减少,与光电二极管为4 × 4微米的小相机目前在消费市场。 6.7微米像素的CCD相机的一个典型的MTF曲线图7所示。 60%的对比度正弦波投射到传感器表面的空间频率上的横坐标和纵由此产生的调制比例绘制。极限分辨率通常被定义为3%调制水平。
如果每个解析单位(许多研究者喜欢每解析单元的三个样本,以确保充足的采样)至少有两个样本,一个对象的足够的分辨率只能达到。落射荧光显微镜的情况下,从1.4数值孔径镜头使用550纳米波长阿贝衍射极限的解析单位为0.21微米。如果雇一个100X的目标是,预计的衍射极限的位置上面对的CCD大小为21微米。将只允许一个传感器尺寸为10.5 × 10.5微米分辨率的光学和电子相匹配,以7 × 7微米传感器大小的首选。虽然在防治荒漠化公约“的小型传感器空间分辨率提高,他们也限制了设备的动态范围。表1提供了建议的传感器像素大小的荧光显微镜中常用的目标。
Objective (Numerical Aperture) | Resolution Limit (Micrometers) | Projected Size on CCD (Micrometers) | Required Pixel Size (Micrometers) |
---|---|---|---|
4x (0.20) | 1.5 | 5.8 | 2.9 |
10x (0.45) | 0.64 | 6.4 | 3.2 |
20x (0.75) | 0.39 | 7.7 | 3.9 |
40x (0.85) | 0.34 | 13.6 | 6.8 |
40x (1.30) | 0.22 | 8.9 | 4.5 |
60x (0.95) | 0.31 | 18.3 | 9.2 |
60x (1.40) | 0.21 | 12.4 | 6.2 |
100x (0.90) | 0.32 | 32.0 | 16.0 |
100x (1.25) | 0.23 | 23.0 | 11.5 |
100x (1.40) | 0.21 | 21.0 | 10.5 |
的CCD的电荷存储能力是成正比的个人光电二极管的尺寸,这样,电子存储的Zui大数量是交叉??的每个光电二极管的截面积的约1000倍。因此,防治荒漠化公约“7 × 7微米光电二极管应该有一个Zui大的49000电子或空穴的电荷存储能力(全阱容量)。一个洞地区的硅电子来检测到的光子构成同样有效和实用的的措施。 “电子”一词,将主要用于整个讨论,尽管许多CCD的读出孔,而不是生成的电子数。由于CCD的不具备固有的增益,是积累了一个电子 - 空穴对每个检测到的光子。通常定义为全阱容量除以相机噪声的CCD的动态范围。相机噪声的总和,在正交,黑暗和读出噪声。在CCD设计的Zui新改进,大大减少到可以忽略不计的水平和减少噪音约10%的电子像素读出黑暗的负责。即使是室温摄像机可能有这么低的暗信号,它可以为10秒或更少的整合期忽略。冷却进一步降低了暗信号,并允许更长的整合期,长达几个小时,没有明显的暗电荷积累,。因此,一个49000电子以及与10读出噪声和暗噪声可以忽略不计的电子能力的CCD的动态范围是4900左右,需要一个12位模拟到数字的转换,或4096灰度级分辨率,充分利用图像传感器的动态范围。
一个CCD与49000电子全阱容量达到Zui大,约220(49,000的平方根)的信号/噪音。当然,相机噪音会增加,在正交的光子统计噪声和减少低于此值的Zui大信号噪声。任何图像中的同质区域的噪声信号的一个简单的估计可能是从地区除以该地区的强度标准差的利息的平均强度。
消费类相机经常使用的一个矩形格式CCD,宽高比为4:3。这意味着,图像的高度,将3 / 4的宽度,以符合基于我们对世界的景观视野的视频标准。事实上,为HDTV设计的消费级产品的Zui新一代采用宽高比为16:9。另一方面,科学成像,是Zui好的,因为它们更适合于数字图像处理,制成的方形像素的正方形图像。
CCD传感器均匀,一般都是很不错的,低于10%的光电二极管之间的增益变化。然而,遮光可介绍,从CCD相机因为电荷转移效率低下的形象。防治荒漠化公约“的运作要求,每包构成一个光电二极管的电荷转移到读出放大器。这种转移是通过一系列的并行和串行的转变,取代沿走向一个单一的包含的读出放大器的角球芯片负责行。如果读出放大器是在上部的右上角,1000 × 1000的CCD传感器,电荷从感光Zui接近那个角落将被移入串行移位寄存器(平行移动)只有一次向上和一旦向右(串行移位)达到放大器。另一方面,在左下角的光电二极管的电荷向上移动被读出的1000倍和向右的1000倍。如果传输效率是每个班次的99.9%,只有13.5%的左下角光电二极管积累的电荷会停留后所需的2000转变。这种电荷损失将使左下角比右上角暗,也往往会模糊或涂抹,地区的形象,因为由相邻的光电二极管的收费外溢。使用蓝色的像素为代表的综合的电荷密度图,说明了这个概念是示意图。在较低的左上角的CCD像素(Zui远的像素 - 深蓝色)是慢慢失去的电荷转移第一并行到串行的移位寄存器,然后连续输出节点的颜色强度。一个像素接近的节点(在右上角“Zui近”像素)也说明了在深蓝色的,只有经过两步跳转到收益率在输出节点上积累的电荷转移效率99.8%。
慢扫描CCD相机增加冷却CCD和传输速率放缓的电荷转移效率。高速视频率CCD相机所需的电荷转移,需要不同的策略。在这些相机中,读出放大器的增益调整,以补偿从每行采样图像区域以外的额外的像素丢失负责。较低的行所需的额外收益,必然增加了传感器的高度纠正的地区的噪音。
一些在读出速度以及传感器允许通过慢扫描CCD相机的像素构成的大小控制。视频率CCD相机更简单,不容许这样的控制。读出放缓会降低放大器的噪声与阅读充电,一个有利的形势时,光子通量很低,信号可以产生相对缓慢(在一两秒钟,而不是在33毫秒)。科学级CCD相机通常提供两个或两个以上的读出率,使速度可能会兑噪音。
在科学级CCD的像素大小分级,从相邻的光电二极管集群负责汇集和处理,就好像它从一个更大的探测器的过程中可能会增加。分级负责的几个转变为串行寄存器和输出节点的存储区域发生之前读出。分级的程度上取决于有多少变化发生之前读取所存储的电荷与唯Yi的串行寄存器(通常是一个单一的光电二极管的两倍)或输出节点(通常为3倍的电荷存储能力的限制,一个光电二极管)。Zui大充电串行寄存器和输出节点的存储容量是不是在荧光显微镜应用的关注,因为分级,时轻时的水平非常低,和几个光子检测。分级使研究者贸易空间分辨率,灵敏度。
有各种科学的市场上的CCD阵列和单个像素的尺寸,具有广泛的。表2列出了一些Zui流行的CCD数字成像相机在显微镜发现。目前,Zui流行的CCD是索尼ICX205AK隔行传输逐行扫描芯片,支持高帧率30帧/秒的读出速率。这种CCD具有一个1360 × 1024的有源像素阵列生产8毫米的使用4.65 × 4.65平方微米像素图像的大小。该芯片还具有高灵敏度,低暗电流,低拖尾,出色的antiblooming特点,和一个连续可变快门速度。
Manufacturer and Model | Format | Pixel Size (Microns) | Array Size (Millimeters) |
---|---|---|---|
Kodak KAF-2001CE | 1732 × 1172 | 13 × 13 | 22.5 × 15.2 |
Kodak KAF-3000CE | 2016 × 1512 | 9 × 9 | 18.1 × 13.6 |
Kodak KAF-3040CE | 2144 × 1432 | 6.8 × 6.8 | 14.6 × 9.7 |
Kodak KAF-6302CE | 3052 × 2016 | 9 × 9 | 27.5 × 18.1 |
Kodak KAI-4000 | 2048 × 2048 | 7.4 × 7.4 | 15.16 × 15.16 |
Sony ICX205AK | 1392 × 1040 | 4.65 × 4.65 | 7.6 × 6.2 |
SITe ST-002A | 2048 × 4096 | 15 × 15 | 30.72 × 30.72 |
Marconi CCD 42-90 | 4608 × 2048 | 13.5 × 13.5 | 27.6 × 62.2 |
Marconi CCD 48-20 | 1028 × 1033 | 13 × 13 | 13.3 × 13.3 |
Philips FTF3020-C | 3072 × 2048 | 12 × 12 | 36.8 × 24.6 |
Philips FT18 | 1024 × 1024 | 7.5 × 7.5 | 7.68 × 7.68 |
慢扫描CCD相机也允许地区的利益读出。这意味着,部分可显示选定的图像和积累的电荷的其余部分丢弃。帧速率一般增加与减少的探测区域的大小。例如,一个具有1000 × 1000传感器尺寸和10帧/秒的输出率的CCD可以产生100帧/秒,如果读出的地区是减少到100 × 100二极管。通过交易场的关闭和帧速率,研究人员可以调整到更广泛的实验情况下比固定的帧速率视频摄像头可能。
弱光级成像的荧光
由于在氧气存在的(“漂白”)和限制可以涉及一个区域的荧光数字荧光photodestruction的问题,各种敏感电子探测器使用荧光显微镜。 5-10%,只有约发出的光从激发荧光收集并传输到传感器在一个典型的落射荧光显微镜。捕捉这个有限的光通量尽可能有两种方法:由慢扫描CCD的集成,如先前所描述的,或图像增强和捕获视频率或逐行扫描的CCD相机。总的结论是,一个冷,慢扫描CCD相机总是产生比加强防治荒漠化公约的信号对噪声,提供了足够的积分时间。
开发用于军事用途,以提高我们的夜视图像增强器(参见图9到11的例子)。他们有一个由微通道板电子倍增器和磷光输出画面输入光阴。在这些设备中Zui新一代的光阴,而类似的光电倍增管,具有更高的量子效率(高达50%)在光谱的蓝绿色的结束。微通道板的增益可调在一个典型的Zui大的约80,000(在输入端检测到的光子信息80000光子脉冲从荧光屏)广泛。荧光粉匹配眼的光谱灵敏度,往往是不理想的CCD。强化CCD的分辨率取决于增压器和“防治荒漠化公约”,但通常是有限的,以增强微通道板的几何单CCD的约75%。Zui新一代的图像增强器(蓝加表示第三代,有时甚至第四代,图9)采用较小的微(直径为6微米)和更好的包装与结果的分辨率和消除大幅增加,比以前的型号几何鸡钢丝固定模式噪音困扰早期设备。
图像增强减少intrascene动态范围相比,慢扫描CCD相机,它是很难获得超过256倍的强度范围从强化CCD相机(8位)。增强器增益,可能会迅速和可重复改变,以适应场景的亮度变化,从而增加了interscene的动态范围。事实上,由于图像增强器,可快速门控(在几纳秒或关闭),相对明亮的物体,可以减少在“关于”时间显示。门控,可变增益加剧CCD相机是商用12为了一个数量级的动态范围。门控,加大CCD相机所需的大多数时间分辨荧光显微镜的应用,因为探测器必须打开并在纳秒或它的增益迅速与光源同步调制。
光阴以及微通道板的电子乘法噪声热噪声减少加剧CCD相机的噪声信号,下面的慢扫描CCD。这些组件的光子通量的统计性质所造成的噪音的贡献依赖于设备的增益和光阴的温度。一般来说,减少集约化阶段的增益,以限制噪声,虽然加剧CCD相机与冷却的光阴。
强化CCD相机有一个非常快的响应时间常数输出荧光粉,往往是CCD相机读出图像采集Zui慢的一步的限制。由于光线较暗的通量,从绑定到活细胞内的荧光或产生,加剧的CCD相机经常研究动态事件和离子敏感荧光成像比例。两个不同的激发或发射波长的图像的同时或几乎同时收购所需的比例,成像和CCD相机有愈演愈烈所需的速度和灵敏度。
图像增强器和CCD相机的混合体,是Zui近推出的电子轰击CCD(EBCCD;图10)。在此设备中,检测到的光子一个类似的图像增强的光阴。释放的电子被加速跨越的CCD背面的差距和影响。这些高能电子产生在防治荒漠化公约“的多个收费在几百温和增益。该设备的优点是冷却的,慢扫描CCD额外的增益和随行的速度;的主要缺点是较低的量子效率的光阴和减少动态范围。强化CCD相比,电子轰击CCD通常有较高的空间分辨率和更好的信号在适度的光照水平对噪声,但有限的增益调整范围和适度的低光水平的检测能力,使电子轰击CCD的摄像头;固态相当于过时薛(图11硅增强靶)。
电子与视觉检测
人眼如何用电子探测器进行比较呢?图6说明了眼的光谱灵敏度曲线,对应于明视和暗视觉,视锥细胞和杆(图12)所产生,分别。Zui高灵敏度在绿色与明视觉Zui大量子效率为3%和10%为暗(明视在555纳米和507纳米的暗)。我们的空间分辨率不统一,因为视锥细胞的分布并不均匀。密度Zui高的发生在黄斑中心凹锥体之间的距离约为1.5微米,给我们一个5至6微米,空间分辨率限制在视网膜上。消色差(黑白)恒定的光照条件下,视觉intrascene动态范围只有大约50倍(6位)。我们的视觉色素视紫红质,展品热噪声小,暗适应后的Zui低检测信号,约100至150光子瞳孔或约10至15日在视网膜中的光子。信号/噪音眼视觉检测限约为3:1。滞后是20毫秒左右,在高光水平和大约100毫秒,在昏暗的照明。
很明显,我们的眼睛相比,一个科学级CCD相机具有更广泛的光谱灵敏度,量子效率高得多,更大的整合能力,更均匀性,更好的intrascene动态范围(更多的“比特”),类似的或更高的信号/噪音,但空间分辨率较低。当对我们的视觉系统相匹配,低光级相机具有更广泛的光谱范围内,较少的滞后和更高的灵敏度和分辨率光子有限的条件下下。
选择适当的相机
没有一个单一的探测器将满足所有要求,在荧光显微镜,研究者往往是被迫妥协。此外,选择是困难的,因为慢扫描相机是越来越快,视频速率相机往往冷却。
当时间是Zui重要的参数,加剧相机往往是唯Yi的选择。如果受调查的事件是迅速的,但可以精确地触发,慢扫描CCD经营爆裂或高速模式可能是合适的。然而,当事件是不容易预测和标本必须不断在低入射光通量监测,强化CCD探测器的选择。出于这个原因,单分子荧光的研究通常采用的加剧CCD相机。
当时间为影像整合,慢扫描CCD相机通常会跑赢加强在各个领域的的相机,在很大程度上是由于其较高的量子效率和更低的噪音。冷却总是提高了相机的性能,但差异可能并不明显,积分时间是几秒钟或更少的数字化水平是10到12位或更少。对于涉及数字反卷积的应用,探测器的选择是一个冷却,科学级,慢扫描相机,能够生产高解析度,14位到16位图像。然而,一些Zui新的CCD有这样的整合期,必须限制,以避免井饱和,因此,动态范围和峰值噪声信号可能没有比强化CCD小像素。
两种类型的彩色CCD相机用于科学应用:单CCD与波长的选择过滤器或三个传感器(三片)相机。都使用的过滤器产生的场的观点红,绿,蓝的版本。单传感器相机采用贴壁的过滤器,过滤器轮或液晶可调谐滤波器,以获得红,绿,蓝图像。当一个可调的过滤器或过滤器轮的使用,三幅图像,必须获得序列。三个传感器的摄像头有一个分束棱镜和修剪过滤器,使每个传感器的形象合适的颜色,并同时获得所有三个图像。彩色摄像机总是不到因为额外分光波长选择元件的单色同行敏感。在某些应用中,特别是免疫,能同时捕获多个波长的敏感性的损失所抵消。此外,一些彩色摄像机采用压电控制易位机制略微抵消CCD实现更高的分辨率,从而提高了采样频率。
在Zui近的CMOS摄像头的表现预示着为这些设备在荧光显微镜未来的一个潜在的重要作用改善。 CMOS摄像头都在一个芯片上集成的格式与每个光电二极管放大器和数字化。每个像素的单个放大器有助于降低噪声和失真水平,但他们也诱发称为“固定模式噪声”,从单个像素放大器的开关和采样的文物出现一个神器。这是表现“斑驳”行为在CMOS有源像素传感器设备产生的图像的重现模式。大量的研究工作已经在解决这个问题的投资,残余的噪声水平,Zui近已大幅减少CMOS传感器。结果是一种廉价,结构紧凑,多功能探测器没有电荷转移的问题相结合的硅检测的美德。 CMOS传感器可以操纵单个光电二极管获得,地区利益的读出,高速采样,电子快门和曝光控制。他们有非凡的动态范围以及计算机接口的理想格式。很可能,他们将在不久的将来取代科学应用CCD相机。