一.酵母菌形态观察及死活细胞辨别。
1.吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同对酵母菌死细胞数目有何影响?是剖析其原因。美蓝是一种无毒性的染料,它的氧化型呈蓝色,还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时,由于细胞的新陈代谢作用,细胞内具有较强的还原才能,能使美蓝由蓝色的氧化型变成为无色的还原型。因此,具有还原才能的酵母活细胞是无色的,而死细胞或代谢作用微弱的朽迈细胞则呈蓝色或淡蓝色,借此即可对酵母菌的逝世细胞和活细胞进行辨别。@美蓝浓度高了,代谢不太活泼的活细胞也会被染色,从而使视察到的死细胞较多,活细胞较少;反之,则代谢微弱的细胞也能还原美蓝,不被染色,从而使观察到的死细胞较少,活细胞较多。
二. 细胞的简略染色和革兰氏染色.
1. 革兰氏染色中那一步是症结?为什么?你是如何操作的?革兰氏染色的要害步骤是:乙醇脱色(是脱色时光)。假如脱色过度,革兰氏阳性菌也可被脱色而被误以为是革兰氏阴性菌;如脱色时间过短,革兰氏阴性菌也可被脱色而被误以为是革兰氏阳性菌。脱色时光的是非还受涂片的厚薄,脱色是玻片晃动的快慢及乙醇用量的多少等因素的影响,难以严厉规定。
@2. 固定的目标之一是杀死菌体,这与自然死亡的菌体有何不同?自然死亡的菌体本身已经部分自溶,构造已经转变。固定杀逝世细菌时细菌构造是坚持死亡时的状况的。
@3. 不经复然这一步能否区分革兰氏阳性菌和阴性菌?能。在酒精脱色后,不被酒精脱色而保存紫色者为革兰氏阳性菌(G+),被酒精脱色为革兰氏阴性菌。Zui后一步用番红染液复染,是为了让结果更明白。
4. 涂片为什么要固定,固定适应注意什么问题? a 杀死细菌并使菌体黏附与玻片上;b 增添其对染料的亲和力。固定时应注意:手持玻片,菌模朝上,在微火过3次(手指触摸玻片反面,不烫手为宜),固定时应尽可能保持细胞原有形态,防止细胞膨胀或压缩。
三. 霉菌 放线菌的形态察看 .
1. 镜检时,如何区分基内菌丝与气生菌丝?,基内菌丝生长必定时光后在显微镜下视察时,一般气生菌丝色彩较深,直生或分枝丝状,比基内菌丝粗;而基内菌丝色浅、发亮,可看到横隔膜,继而断裂成球状或杆状小体。。
2. 显微镜下细菌 放线菌 酵母菌和霉菌的重要差别是什么?
四. 玻璃器皿的洗涤 包扎与灭菌.
1. 高压蒸汽灭菌开端时为什么要将锅内排尽?灭菌后为什么要待压力下降到“0”时,才干打开排气阀,开盖取物.由于空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压,所以,当水蒸汽中含有空气时,在同一压力下,含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。假如压力未降到0时,打开排气阀,就会因锅内压力忽然降低,使容器内的培养基由于内外压力不平衡(压力忽然降落而产生复沸腾)而冲出烧瓶口或试管口,造成培养基等液体沾湿棉塞或溢出等事故。
2. 设计实验计划,比拟干热灭菌和湿热灭菌的后果。以下试验计划有关操作均遵守无菌操作条件和等量原则。
(一) 实验材料:试管 镊子 酒精灯 嗜热脂肪芽孢杆菌 ATCC 7053 菌片 纸片(与菌片同大小 同材料)溴甲酚紫蛋白冻水培养基(已灭菌)等实验资料(材料有余)。
(二) 对比组:取9支干净试管,分为A1 B1 C1 三组(每3支一组),将A1 组中放入菌片,B1 组中放入纸片,C1组中什么也不加;不经灭菌,直接参加溴甲酚紫蛋白冻水培养基(等量)。
(三) 试验组:取18支干净试管,分为A21 A22 B21 B22 C21 C22 六组(每3支一组),将A21 A22 组中参加菌片,B21 B22 中加入纸片,C21 C22 中什么也不加;其中A21 B21 C21 进行160摄氏度 2小时干热灭菌;其中A22 B22 C22 进行121摄氏度 20分钟湿热灭菌,灭菌完毕,冷却后加进溴甲酚紫蛋白冻水培育基(等量)。
(四) 恒为培养:将上述所有试管按分组在56摄氏度恒温条件下培养48小时。
(五) 结果处置:将培养后的结果进行记载,制表进行比拟,得出灭菌后果。
(六) 反复实验:多次(10几次)重复以上试验步骤,得出广泛成果。
3. 为什么干热灭菌比湿热灭菌所需温度高 时间长?
在湿热条件下,有水蒸汽的作用:
a高温水蒸汽导热比干空气要快;
b高温水蒸汽冷凝变水时有放热进程;
c高温水蒸汽能穿透细菌的细胞膜,直接进进细胞内损坏细胞; c高温水蒸汽能水解一部分细胞构造,加速导热。(湿热中细菌菌体接收水分,蛋白质较易凝固,因蛋白质含水量增添,所需凝固温度下降;湿热的穿透力比干热大;湿热的蒸汽有潜热存在,每1克水在100℃时,由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量。这种潜热,能敏捷进步被灭菌物体的温度,从而增长灭菌效率。)
五. 培养基的配置;
1. 配制牛肉膏蛋白胨造就基,有哪些操作步骤?那几步易出错,如何防止?称取药品—加热溶化—分装—加棉塞—包扎—灭菌—搁置斜面 .易出错的步骤有:
a 称取药品 称取时钥匙专用,易吸水得药品要快速称取;
b 加热溶化 参加药品后要用玻璃棒不停搅拌,以免糊底;
c 分装 分装时造就基不能粘在三角瓶(或试管)口,以免接种时染菌;
d 搁置斜面 斜面长度约试管长度一半为宜。
2. 配制培养基的一般原则是什么?
a 目标明白
b 养分和谐
c 理化合适
d 经济节俭
六. 平板菌落计数法:
1. 平板菌落计数法的原理是什么? 它实用于那些微生物的计数?平板菌落计数法是将等测样品经恰当稀释后,其中的微生物充足疏散为单个细胞,取必定量的稀释液接种到平板上,经过培养,由每个单细胞生长滋生而形成的肉眼可见的菌落,即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数,依据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。(但是,由于待测样品往往不易完整疏散成单个细胞,所以,长成的一个单菌落也可能来自样品中的2~3或更多个细胞。因此平板菌落计数的成果往往偏低。现在常应用菌落形成单位)。@平板计数法是依据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个微生物滋生而形成的现象进行的,也就是一个菌落可代表一种微生物(并不尽对)。通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物的数目。
2. 菌落样液移入培养皿后,若不尽快地倒入培养基并充足摇匀,将会呈现什么结果?为什么?涌现的结果是:形成菌落过于集中,不能形成均匀分布的单菌落,导致无法计数。@由于:若不立即摇匀,菌体常会吸附在皿底上,不易形成均匀分布的单菌落,从而影响计数的正确性。
3. 要获得本次试验的胜利,那几步Zui为要害?为什么? a 稀释菌液 若在稀释时移液管混用可使稀释梯度不正确,从而导致计数误差; b 稀释倒平板 若再加入菌液不立即倒入培养基,可使菌体黏附于皿底;若不注意培养基温度,温渡过高会将菌体烧死,温渡过低会使培养基一倒入立即凝固,从而菌体不能均匀分布;@倒入培养基需立即摇匀,否则菌体常会吸附在皿底上,不易形成均匀分布的单菌落,从而影响计数的精确性。
4.平板菌落计数法与显微镜直接计数法相比有何优缺陷?微生物显微镜直接计数法随机性大,所以对菌体数目不能做出较为宏观,全面的反映.显微镜直接计数法一般与血球计数板配套应用.但显微镜直接计数法的长处是快速,视察到马上可以计数,而计的是细菌总数。平板菌落计数法Zui大的毛病是速度慢,须要平板上长出菌落一段时间后才干计数.但是由于平板菌落计数法通常做梯度稀释,所以计数的线性范畴大.由于是菌悬液涂布,所以比拟均匀,能较好的反响菌落的疏密水平.重复性,平行性很好,而计的是活菌数。是经典的计数方式.
七. 显微镜直接计数法:
1. 为何用血细胞计数板可计得样品总菌值?叙述其实用范畴。
a 计数室体积必定;
b 在显微镜下,不经染色不能辨别菌体的逝世活,使计数所得的数目为一定体积内的总菌数,从而计得样品中总菌值。实用范畴:可单细胞存在的细菌酵母菌或显丝状生长的真菌,放线菌所生的包子等。
2. 为什么计数室内不能有气泡?试剖析产赌气泡的可能原因。
a 气泡会盘踞计数室的空间,导致计数室中的菌体个数计数偏小,Zui后导致计数成果偏小。
b 计数室内的气泡,可影响菌液的随机散布,使计数发生误差。
产活力泡原因:
a 操作不当,先放菌液再盖盖玻片;
b 计数室洗涤不清洁;
c 盖玻片移动,造成空气进入而产赌气泡。
3. 试剖析影响本实验结果的误差起源及提出改进办法?
1、仪器误差:所用器材均应干净清洁,并且计数板计数区不应当有擦痕。
2、计数室内可能有气泡。由于酵母细胞并没有染色,看起来是透明的,有气泡很轻易被计进,使数值偏高;并且,气泡会影响菌悬液的随机散布。 改良:若产赌气泡,则用吸水纸吸出。
3、菌体在计数板上散布不均,当用选取5格计数时,会造成很大误差。改良:应使菌液自然流入并混匀,进行察看时尽可能多数几个格子。
4、配制稀释液时汲取的浓渡过高或过低,导致稀释液浓度和原液不成准确比例,盘算时发生误差。应将原液摇摆均匀后取中部的液体进行稀释。
5、由于数菌体数目时视觉疲劳而导致的视觉误差。应多人察看,取记载均匀数。
6、计数时可能将格四周的菌都盘算在内了,使数值偏高。改良:谨遵一个规矩,计上不计下,计左不计右,不可以反复计数。
7、可能呈现有出芽的酵母菌,将出芽的酵母菌按两个计数了,使数值偏高。改进:计数时,只有当芽体于母细胞一样大的时候,才干计为两个。
8、微量移液器的Zui小量程太大,在加样时,轻易加多,使盖玻片鼓起,血球计数板所技巧的体积变大,终极结果偏大。改进:用量程的小的微量移液器并少加一些。
八. 微生物的纯培养技巧:
1. 假如一项科学研讨内容需从自然界中筛选到能发生高温蛋白酶的菌株,你将如何完成?写出实验方案(产蛋白酶菌株在酪素平板上能形成降解酪素透明圈)。以下实验计划有关操作均遵守无菌操作条件:一 资料筹备1 土壤【有机质(特殊是蛋白质)含量丰盛的土壤】
2 灭菌生理盐水(0.85%NaCl)
3 灭菌移液管
4 添加酪素的B—4(牛肉膏蛋白胨完整培养基)经灭菌
5 B—4斜面(经灭菌)
6 其他资料:接种环 酒精灯等
二 操作方式
1在盛有10ml灭菌生理盐水的烧杯中添加1g土壤,配成悬浮液;
2 稍静止后,用灭菌移液管移取部分上清液,将其制成10^4—10^6倍的稀释液;
3 用灭菌移液管汲取各稀释液用稀释倒平板法(或涂布平板法)将其接入添加酪素的B—4平板上;
4 在55—65℃下培育1—2天;
5 挑取形成降解酪素透明圈的菌落,转接入B—4斜面上培养;(若无特定菌落形成,则需另取土样从开端重复实验)
6 将B—4斜面上的菌落再用平板纯培育,一次反复2—3次后即可得到纯造就(镜检);
7 纯培养细菌中蛋白酶的提取及活性鉴定【摇瓶培养(若提取蛋白酶及其活性正常,则纯培养胜利,否则,重取土样重复以上试验)】。