研究和医学中的蛋白激酶抑制剂
Jeffrey R. Simard , Daniel Rauh , 酶学方法, 2014
超分辨率显微镜：共定位显微镜 (2CLM) 与 GFP 和 RFP 融合蛋白（骨癌细胞核）用 Vertico-SMI/SPDMphymod 显微镜测量的宽视野区域 (470 µm 2 )中的 120.000 个定位分子
5 带 FLiK 的 HTS
5.1 适应 HTS 格式
FLiK 检测技术可以轻松适应高通量检测板（96 孔、384 孔和 1536 孔格式）。将该测定法应用于小体积微量滴定板可显着减少所需的激酶量，同时提高通量以实现快速筛选大型化合物库。应采取以下步骤使 FLiK 测定适应 HTS 格式：
1.制备 50 n M FLiK 激酶的悬浮液，并将等体积的样品放入黑色测定板的几个孔中。将 HTS 板放入荧光板读取器中，并根据用于标记激酶的荧光团设置激发波长。
2.在存在和不存在阳性对照抑制剂的情况下测量激酶的发射光谱，以验证与比色皿格式相比，HTS 格式中所需的最大值没有发生变化。对于某些激酶，我们观察到在 HTS 板中测量时，一个或两个最大值发生了多达 10 nm 的偏移。如果观察到变化，请调整用于计算 HTS 板中比率的波长。
3.使用包含阳性和阴性对照的几个孔计算HTS 测定的Z ' 因子。
4.评估蛋白质稳定性并估计配体结合达到平衡所需的孵育时间。准备一排孔，其中包含一系列稀释的化合物和固定浓度的 FLiK 激酶。在一段时间内测量相同的板并监测K d结合曲线的左移。此外，在每个时间点重新计算Z ' 因子。选择一个孵化时间，这会产生一个稳定的K d值和最大的检测窗口。检测窗口的下降或数据点重现性的下降通常表明蛋白质不再稳定，从而导致计算得到的Z值降低'-因子值。为了在较长的孵育时间内尽量减少这些影响，请保持板密封（在湿度室中或使用粘合剂密封）并避光。
5.如果需要改进K d值和Z ' 因子，可以测试几个测定变量以检查它们对测定质量和重现性的影响。应对每个 FLiK 测定进行这些优化。DMSO 浓度（与化合物一起添加）、去污剂类型、去污剂浓度、激酶浓度、每个孔中的体积、板类型、孵育时间和孵育温度是几个例子。我们发现 DMSO 对蛋白质稳定性至关重要，而洗涤剂类型和浓度可以改变测量的K d值，具体取决于测定。 建议使用 < 0.01% (v/v) 的洗涤剂浓度。
6.使用优化的检测条件，使用液体处理机器人运行模拟 HTS 场景，将激酶分配到两个检测板中。将化合物添加到一个板（阳性对照），同时仅将车辆（含 DMSO 的缓冲液）添加到另一板。孵育板并测量。评估完整的检测板以获得良好的信号均匀性，并计算最终优化 HTS 检测的Z ' 因子。
5.2 化合物库的 HTS
我们已经使用各种 FLiK 激酶进行了几次 HTS，发现 50–100 n M激酶足以避免许多荧光伪影，并确保来自荧光团标记的激酶的信号足够大以克服许多化合物在筛选时的固有荧光最大浓度为 10–20 μ M。典型的初级筛选包括每孔含有一种化合物的检测板，最大浓度为10–20 μM. 为了单独评估化合物的背景荧光，可以对每个化合物板进行两次筛选，一次仅使用缓冲液，一次使用 FLiK 激酶在同一缓冲液中进行背景扣除。 通常，选择与 10–20 μM的阳性对照相比结合至少 50% 的化合物进行后续筛选。在初步筛选后，选择命中并以剂量反应格式重新筛选，以确认与激酶的结合并确定K d值。下面提供了 HTS 的一般指南。
- 绘制 384 孔筛选板的计划布置，其中包含将添加到筛选板的化合物的位置。一定要为阴性 (DMSO) 和阳性 (DFG-out 抑制剂) 对照包括几个井。
- 在 100% DMSO 中制备所有复合原料（单点或剂量反应）。将化合物转移到深孔检测板中，并在检测缓冲液中进行预稀释。将阳性和阴性对照放入预稀释板的适当孔中。该板是用于测定的抑制剂储备板。理想情况下，抑制剂储备板中 DMSO 的浓度应为 5% (v/v) 或更低。
- 使用多通道移液器或液体处理装置将化合物从预稀释的抑制剂储备板转移到空的小体积 (20 μL)、黑色、384 孔 HTS 板。
- 使用多通道移液器或液体处理装置将缓冲液中的 FLiK 激酶转移到检测板。添加较大体积的激酶溶液应足以混合每个孔的内容物。激酶和化合物的最终混合物在检测板中应为 1 倍，DMSO 的最终浓度理想地应为 1% (v/v) 或更低。
- 如第 1 步所述，将盘子密封并存放在黑暗中。5.1 节的4使用先前确定的孵育时间和温度。
- 孵化后，从每个板上取下密封件，并将板放在微量滴定板读取器内，以测量两个所需波长的荧光发射强度。根据仪器附带的软件，读数将是计算的比率值或在每个波长处单独测量的两组发射强度。
- 识别触发预期荧光响应的化合物，并使用与前面描述的初级筛选类似的程序以剂量-响应格式重新筛选这些化合物。
5.3 数据分析、荧光伪影和陷阱
与任何基于荧光的测定一样，假阳性的识别可能很棘手，有时甚至很困难。特别是在 FLiK 分析的情况下，识别此类化合物可能非常耗时，尤其是因为很难运行所有必要的控制来识别所有可能的荧光类型文物。前面描述的使用背景板的方法将快速识别内在化合物荧光，可以很容易地减去这些荧光，以揭示 FLiK 激酶中使用的荧光团标记的发射信号贡献。在许多情况下，从化合物中减去固有信号表明，计算出的荧光团发射强度的比率以剂量依赖性方式变化。迄今为止，我们已经鉴定并证实了几种化合物的结合，这些化合物也具有内在背景荧光。
背景板的使用不会考虑其他类型的荧光伪影，例如荧光团和某些化合物之间的猝灭或协同相互作用。如果将化合物与游离的、未反应的荧光团置于悬浮液中，则伪影更难以识别并且可能不一定被观察到，因为反应性荧光团的荧光特性和行为通常会在与蛋白质结合时发生变化。一旦缀合，环境敏感荧光团的荧光发射取决于激酶构象提供的局部环境。通过与激酶结合，配体与荧光团非常接近，这种近距离可以使观察到的淬灭或协同相互作用成为可能，否则溶液中的游离荧光团不会发生这种相互作用。然而，Simard、Grutter 等人，2009 年）。我们发现，这些类型的化合物往往会改变整个光谱的整体强度，但也会以剂量依赖性方式引起计算比值的预期变化。换句话说，虽然光谱的绝对强度已经改变，但荧光团响应结合的行为并未受到影响。
值得注意的是，由于该分析能够报告仅诱导某些构象变化的配体，因此 FLiK 分析中的命中率往往较低。尽管可能会结合更多的化合物，但只有那些诱导所需构象变化的化合物才会被选择进行随访，从而可以将较小的命中集合推进到替代测定中的后续筛选。我们没有针对每种类型的荧光伪影开发独特的 FLiK 分析，而是使用下面描述的多管齐下的方法来清除并去除残留在这一小部分命中的配体，这些配体可能不会真正结合或诱导所需的构象变化。
- 执行第 5.2 节中所述的主屏幕并识别命中，这会改变 FLiK 激酶的比率。
- 准备命中作为稀释系列，并在 FLiK 测定中以剂量反应格式重新测试它们，除了包含 FLiK 激酶的测定板外，还使用背景板。孵育，然后在两个选定的波长测量每个板（激酶板和缓冲板）。使用每个波长的值计算每个化合物浓度的比率值。计算背景校正和未校正数据的比率。无论背景荧光是否计入计算中，非荧光化合物都会产生相同的结果。相比之下，荧光化合物会产生非常不同的结果。在确定化合物是否有效之前，这些化合物应保证对原始数据进行更仔细的分析。通常，以这种格式筛选时，有效命中会产生一条结合曲线。对于荧光化合物，结合曲线可能仅在每个浓度的背景扣除后可见。对于怀疑与荧光团协同或淬灭的化合物，结合的验证可能更加困难。此类有问题的化合物可能被认为不太适合后续研究并从筛选中删除。然而，更保守的方法是将这些化合物包括在具有替代测定的后续研究中。
- 检查FLiK 测定中每个命中的结合动力学。荧光伪影不太可能表现出时间依赖性。这在检查用 DFG-out FLiK 检测屏幕确定的潜在慢结合命中时特别有用，其中激酶在激活环上用荧光团标记。
- 选择一个命中列表，以便在感兴趣的激酶的替代结合测定中进行后续测试（如果有）。荧光偏振测定就是一个例子。荧光预结合探针的置换将改变荧光团的极化并确认命中与激酶结合。
- 如果可用，在基于活性的测定中测试化合物，以确认催化活性的抑制。由于这些类型的测定通常需要磷酸化激酶，如果在 DFG-out FLiK 测定中鉴定出测试命中，则可能会观察到配体效力的变化，其中未磷酸化激酶用于提高实现 DFG-out 构象的可能性。
- 尝试结晶命中，这在所有上述测定中都显示出阳性反应。晶体结构将揭示结合模式的细节，并验证用于初步鉴定化合物的 FLiK 测定。