特殊光学显微镜的原理与使用
特殊光学显微镜的原理与使用
一、暗视野显微镜
（一）原理
1.根据丁达尔效应原理设计的一种在黑色背景条件下观察被检物体的显微镜。
2.不让直射光进入物镜的镜头，而是先让直射光线经过暗视野聚光镜后改变途径，使其斜向射向被检物体。
3.能观察到明视野下看不到的极其微小的物体，可判断物质颗粒的存在与否。Zui高分辨率可达0.004μm——超显微技术。
（二）使用
1.换上暗视野聚光镜并在聚光镜透镜的上表面滴上镜头油。向上缓慢调升聚光镜，使镜头油与载玻片下表面缓缓接触。只有在油滴与载玻片的底面相接触后，光线才能射向标本。
2.将视场光圈适当缩小，用10倍物镜找到被检物体，同时可在视场中看到视场光圈的轮廓像。上下缓慢调整聚光镜，使视场光圈的像清晰可见。
二、相差显微镜
（一）特点
1.光线通过比较透明的标本时，光的波长（颜色）和振幅(亮度)都没有明显的变化。因此，用普通光学显微镜观察未经染色的标本（如活细胞）时，其形态和内部结构往往难以分辨。
2.相差显微镜能通过其特殊装置——环状光阑和相板，利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼可以观察的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强，是我们能比较清楚的观察到普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或者看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构。
（二）原理
镜检时光源只能通过环状光阑的透明环，经聚光镜后聚成光束，这束光线通过被检物体时，因各部分的光程不同，光鲜发生不同程度的倾斜（衍射）。由于透明圆环所成的像正好落在物镜后焦平面，和相板上的共轭面重合，因此，未发生偏斜的直射光便通过共轭面，而发生偏斜的衍射光则经补偿面通过。由于相板上的共轭面和补偿面的性质不同，它们分别将通过这两部分的光线产生一定的相位差和强度的减弱，两组光线再经后透镜的会聚，又复在同一光路上行进，而使直射光和衍射光产生光的干涉，变相位差为振幅差。这样，在相差显微镜镜检时，通过无色透明体的光线使人眼不可分辨的相位差转化为人眼可分辨的振幅差（明暗差）。
（三）结构和装置
1.环状光阑
具有环形开孔的光阑。位于聚光器的前焦点平面上，光阑的直径大小是与物镜的放大倍数相匹配的，并有一个明视场光阑，与聚光器一起组成转盘聚光器。在使用时只要把相应的光阑转到光路即可。
2.相板
位于物镜内部的后焦平面上。相板上有两个区域，直射光通过的区域叫“共轭面”，衍射光通过的部分叫“补偿面”。带有相板的物镜叫相差物镜，常以“Ph”字样标在物镜外壳上。
相板上镀有两种不同的金属膜：吸收膜和相位膜。吸收膜常为铬、银等金属在真空中蒸发而镀成的薄膜，它能把通过的光线吸收掉60%~93%，相位膜为氟化镁等在真空中蒸发镀成，它能把通过的光线相位推迟1/4波长。
3.合轴调节望远镜
是相差显微镜一个极为重要的结构。环状光阑的像必须与相板共轭面完全吻合，才能实现对直射光和衍射光的特殊处理。否则应被吸收的直射光被泄掉，而不应该被吸收的衍射光反被吸收，应推迟的相位有的不能被推迟，这样就不能达到相差镜检的效果。
由于环状光阑是通过转盘聚光器与物镜相匹配的，因而环状光阑与相板常不同轴。为此，相差显微镜配备有一个合轴调节望远镜（在外壳上标有“CT”符号），用于合轴调节。使用时拔去一侧目镜，插入合轴调节望远镜，旋转其焦点，便能清楚看到一明一暗两个圆环。再转动聚光器上的环状光阑的两个调节钮，使明亮的环状光阑圆环与暗的相板上共轭面圆环完全重叠。如明亮的光环过小或过大，可调节聚光器的升降旋钮，使两环完全吻合。如果聚光器已升到Zui高点或降到Zui低点仍不能矫正，说明拨片太厚了，应该换。调好后取下望远镜，换上目镜即可进行镜检观察。
4.绿色滤光片
由于使用的照明光线的波长不同，常引起相位的变化，为了获得良好的相差效果，相差显微镜要求使用波长比较窄的单色光，通常是用绿色滤光片来调整光源的波长。
Olympus厂家生产的相差显微镜在镜检时要使用该厂规定的IF550绿色滤光片作为配套器件。
（四）使用范围
相差显微镜能观察到透明样品的细节，适用于对活体细胞生活状态下的生长、运动、增殖情况及细微结构的观察，因此，是微生物学、细胞生物学、细胞和组织培养、细胞工程、杂交瘤技术等现代生物学研究的必备工具。
（五）操作步骤
1.根据观察标本的性质及要求，挑选适合的相差物镜；
2.将标本放到载物台上；
3.进行光轴中心的调整；
4.取下一侧目镜，换上合轴调节望远镜，调整环状光阑与相板上的共轭面圆环完全重叠吻合，然后取下合轴调节望远镜，换回目镜。在使用中，如需要更换物镜倍数时，必须重新进行环状光阑与相板共轭面圆环吻合的调整；
5.放上绿色滤光片，即可进行镜检，镜检操作与普通光学显微镜方法相同。
（六）注意事项
1.视场光阑与聚光器的孔径光阑必须全部开大，而且光源要强。因环状光阑遮掉大部分光，物镜相板上共轭面又吸收大部分光。
2.不同型号的光学部件不能互换使用。
3.载玻片、盖玻片的厚度应遵循标准，不能过薄或过厚。
4.切片不能太厚，一般以5~10μm为宜，否则会引起其他光学现象，影响成像质量。
三、荧光显微镜
荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成。是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。
（一）部分组成说明
1.光源
多采用200W的超高压汞灯作光源。国产超高压汞灯GCQ-200型性能良好，可以代替HBO-200等型号的进口灯泡。
2.滤色系统
滤色系统是荧光显微镜的重要部位，由激发滤板和压制滤板组成。滤板型号，各厂家名称常不统一。滤板一般都是以基本色调命名，前面字母代表色调，后面字母代表玻璃，数字代表型号特点。
（1）激发滤板
根据光源和荧光色素的特点，可选用以下三类激发滤板，提供一定波长范围的激发光。
①紫外光激发滤板：此滤板能使400nm以下的紫外光透过，阻挡400nm以上的可见光通过。常用型号为UG-1或UG-5，外加一块BG-38，以除去红色尾波。
②紫外蓝光激发滤板：此滤板可使300~450nm范围内的光通过。常用型号为ZB-2或ZB-3，外加BG-38。
③紫蓝光激发滤板：它可使350~490nm的光通过。常用型号为QB24（BG12）。
④Zui大吸收峰在500nm以上的荧光素（如罗达明色素）可用蓝绿滤板（如B-7）激发。
（2）压制滤板
压制滤板的作用是完全阻挡激发光通过，提供相应波长的荧光。与激发滤板相对应，常用以下3种压制滤板：
①紫外光压制滤板：可通过可见光，阻挡紫外光；能与UG-1或UG-5组合；常用GG-3K430或GG-6K460。
②紫蓝光压制滤板：能通过510nm以上波长的荧光（绿到红），能与BG-12组合；通常用OG-4K510或OG-1K530。
③紫外紫光压制滤板：能通过460nm以上波长的荧光（蓝到红），可与BG-3组合，常用OG-11K470AK 490,K510。
3.目镜
在荧光显微镜中多用低倍目镜，如5X和6.3X。
（二）标本制作要求
1.载玻片厚度应在0.8~1.2mm之间，太厚的拨片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需要用石英玻璃载玻片。
2.盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光亦可激发标本。
3.组织切片或其他标本不能太厚，如太厚，激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重叠或杂质掩盖也会影响判断。
4.封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在Ph8.5~9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/L Ph9.0~9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。
5.需用油镜观察时，做好使用特制的无荧光油镜，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。
（三）注意事项
1.严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。
2.应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5~15min，待光源发出的强光稳定后，眼睛完全适应暗室时，再开始观察标本。
3.防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼罩。
4.检查时间每次1~2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3~5min后，荧光也明显减弱；所以，Zui多不能超过2~3h。
5.荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。
6.标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。
7.荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“-”——无或可见微弱荧光；“+”——仅能见明确可见的荧光；“++”——可见明亮的荧光；“+++”——可见耀眼的荧光。