生物显微镜在生物学研究中的应用

2016-06-01技术资料

生物显微镜在生物学研究中的应用

原子力显微镜自从问世以来在生物学研究中有其不可替代的作用,是生命科学研究中不可缺少的工具。原子力显微镜(AFM)技术本身有许多优势,如样品制备简单,可在多种环境中运作,高分辨率等等。本文主要从生物化学、细胞生物学、免疫学和物质超微结构研究等几个方面对其在生物学中的应用进行综述。

RNA

(AFM)的优势

(AFM)是80,SPM)的一种。1986年,Dr. 

Binning因发明扫描探针显微镜而获得诺贝尔物理奖。这种显微镜的放大倍数远远超过以往的任何显微镜:光学显微镜的放大倍数一般都超不过1000倍;电子显微镜的放大倍数极限为100101000倍,可以直接观察物质的分子和原子,这为人类对微观世界的进一步探索提供了理想的工具。

(AFM)本身的优势是其在生物学中得以迅速发展的主要原因。首先,原子力显微镜(AFM)技术的样品制备简单,无需对样品进行特殊处理,因此,其破坏性较其它生物学常用技术()(AFM)能在多种环境()中运作,生物分子可在生理条件下直接成像,也可对活细胞进行实时动态观察;第三,原子力显微镜(AFM)/亚分子分辨率的三维图像;第四,原子力显微镜(AFM)能以纳米尺度的分辨率观察局部的电荷密度和物理特性,测量分子间()(AFM)能对单个生物分子进行操纵;另外,由原子力显微镜(AFM)获得的信息还能与其它的分析技术和显微镜技术互补。

(AFM)还具有对标本的分子或原子进行加工的能力,例如,可搬移原子,切割染色体,在细胞膜上打孔等等。综上所述,原子级的高分辨率、观察活的生命样品和加工样品的力行为成就了原子力显微镜的三大特点。

原子力显微镜(AFM)原理

(AFM)通常使用氮化硅作为一个灵敏的弹性微悬臂,在其尖端有一个很尖的探针用来在样品上扫描。点状物或原子之间的相互作用力通常用Lennard-Jone电位描述:U(r)=-U0[(r0/Z)12-(r0/Z)6]此处Z,U0和r0分别为平衡状态下原子间的能量和距离。当原子间距小于r0时,原子间作用力由吸引力变为排斥力。探针与表面之间的吸引力和排斥力被用于扫描力试验。不同表面方位的探针作用力给出关于表面形态和一些其他表面特征的信息。原子力显微镜(AFM),分别基于排斥作用和吸引作用。原子力显微镜(AFM)试验中,,:F(Z)=2πR0B/3Z3,其中Z,R0为近似显微球针尖的半径,B(AFM),激光二极管发出的一束激光经悬臂反射后,打在一个分裂式光电二极管上,,由于样品表面原子结构起伏不平,,,即可获得样品表面凹凸信息的原子结构图像。原子量级的表面形态记录是原子力显微镜(AFM)

轻敲模式(Tapping 

Mode, TM)(AFM)观察柔软、粘连、易碎的样品方面,TM成像术的出现是一个关键性进步。TM-AFM50000~500000次/秒的频率交替接触和离开表面。由于针尖接触表面造成能量损失,悬臂振荡减弱,这种振幅的减小可以用来鉴别、测量表面状态。当针尖通过表面隆起部分时,悬臂在较小空间内振荡,振荡的振幅同时变小;相反,当针尖通过凹陷处时,,振幅变大。数字反馈回路用来

调整针尖-样品间距以维持恒定的振幅和作用于样品上的力。TM-AFM,为了避免使整个液体细胞在悬臂振荡驱使下进入上下运动状态,必须选择一个合适的振荡频率(通常在5000~40000次/)。这种方法的特点是:当针尖沿XZ方向上撤离样品表面然后再接近,并保持每次撤离的距离相等,如果针尖撤离足够远,那麽针尖对样品的横向作用力就不会被累积,从而可减少针尖对样品的破坏作用。TM-AFM成像的优点在于,它既可以防止针尖与表面粘连和扫描过程中造成的样品破坏,又能接触表面并获得高分辨图像。而且TM-AFM成像具有广阔的线性范围,允许常规样品的重复测试。

使用原子力显微镜(AFM)观察生化过程

随着样品处理技术在液体中成像技术的改善,应用原子力显微镜(AFM)观察复杂的生化过程成为可能。转录过程是基因表达的中心环节,而使用原子力显微镜(AFM)观察蛋白质和DNA的相互作用存在一个矛盾要解决:生物分子需要固定到基底上是原子力显微镜(AFM)的成像基础,而生化反应过程却需要生物分子能相对自由地移动。即使在大量非特异性DNA存在时,RNA聚合酶(RNAP)与启动子间仍存在很高的结合率,人们猜想RNAP沿着DNA的扩散是其原因之一。非特异性复合物在适当条件下沉积后,利用原子力显微镜(AFM)可观察到RNAP沿着DNA滑动,且能在不同的DNA片段间转移。然而加入肝素可终止这些过程,这就进一步证实了RNAP- 

 

DNA相互作用的非特异性。原子力显微镜(AFM)还能对转录的过程进行实时观察,在加入核苷酸后,沉积到云母上的延长复合物沿着DNA模板单向移动。两个对照实验证实RNAP与DNA的相对移动与转录的实际情况相符。在一个对照中,以没有终止子的微环DNA作为模板,在云母上进行转录。在干燥后通过原子力显微镜(AFM)可观察到合成的RNA长链。在第二个对照中,DNA在相同的条件下,在云母上进行转录。不同的是加入的核苷酸用32P标记。通过PAGE对反应产物进行分析,结果显示与云母结合的复合物具有活性,而且转录的速度与用原子力显微镜(AFM)测得的近似生物分子的构象改变也是原子力显微镜(AFM)的重要观察内容。将尿素酶沉积到云母上并用原子力显微镜(AFM)扫描,在液池中加入尿素后发现,悬臂的垂直波动明显增加,这提示由酶活动引起的构象改变能直接通过原子力显微镜(AFM)记录下来。格兰阴性菌的外膜是其保护屏障,它由规则组装的蛋白质通道构成。其中研究较多的是Deinococcusradiodurans的六角形组装中间体(hexago 

nallypacked intermediate, HPI)蛋白。HPI被认为与营养的摄入和代谢物的排出有关。HPI的原子力显微镜(AFM)图像显示了规则的六角形及中央的孔样结构。在液体中成像则发现HPI呈现出“开和“关”两种不同的构象。意义虽不清,但这却显示出原子力显微镜(AFM)在液体中成像的优势。

原子力显微镜(AFM)在研究分子识别中的应用分子间的相互作用在生物学领域中相当普遍,例如受体和配体的结合,抗原和抗体的结合,信息传递分子间的结合等,是生物体中信息传递的基础。原子力显微镜(AFM)可作为一种力传感器来研究分子间的相互作用。这是由于原子力显微镜(AFM)理论上能感应10-14N的作用力,能感应0.01nm的位移,而接触面积可小到10nm2。因此,原子力显微镜(AFM)被用于研究互补的DNA链间、细胞粘附分子间及配体-受体间的相互作用力。生物素(biotin)和抗生物素蛋白链菌素(streptavidin)间有高亲和力,其相互作用的热力学数据也较为清楚。因而,生物素和抗生物素蛋白链菌素是原子力显微镜(AFM)测定特异相互作用力的良好典型。在一经典实验中,用生物素化的小牛血清白蛋白(biotinlated 

bovine serum albumin,BBSA)包裹微球,而微球连在悬臂上形成BBSA功能化探针。然后在有生物素阻断和无生物素阻断的抗生物素蛋白链菌素溶液中测量BBSA功能化探针和BBSA包裹云母间的粘附力。结果显示,无生物素阻断的抗生物素蛋白链菌素溶液中需要较大的力才能将BBSA功能化探针与云母表面分离,力的大小为(0.257±0.025)nN,与分离配体-受体所需的力相符。而在此基础上可推算出其有效的断裂距离为(0.95±0.10)nm。因此,当针尖包裹了特定的分子(如生物素)后,通过针尖和样品间的相互作用可用于辨认表面的相应分子(如抗生物素蛋白链菌素)的位置。现在已出现了商用的修饰探针,这些探针包裹了不同的分子,可用于不同用途的分子识别。因而原子力显微镜将发挥更广泛的作用。

原子力显微镜(AFM)在物质超微结构研究中的应用原子力显微镜(AFM)可以直接观察到表面缺陷、表面重构、表面吸附体的形态和位置、以及有表面吸附体引起的表面重构等。原子力显微镜(AFM)可以观察许多不同材料的原子级平坦结构,例如,可以用原子力显微镜(AFM)对DL-亮氨酸晶体进行研究,可观察到表面晶体分子的有序排列,其晶格间距与X射线衍射数据相符。另外原子力显微镜(AFM)还成功地用于观察吸附在基底上的有机分子和生物样品,如,三梨酸、DNA和蛋白质的表面。海藻酸聚赖氨酸海藻酸(Alginate 

Poly L-Lysine Alginate,简称APA)胶囊薄膜具有半渗透性,构成可以阻止人体免疫系统的成分进入由APA薄膜构成的胶囊,从而使得胶囊内的物质免受免疫系统的侵害。因此,可采用该薄膜胶囊保护人体内移植的组织,延长其在人体内的存活时间。同时,对药物具有缓释效应。APA薄膜的半渗透性同其表面的超微结构有着密切的联系,研究其表面的超微结构对其半渗透性的研究具有重要的意义。已有文献报道了关于采用原子力显微镜(AFM)对APA薄膜的表面结构进行研究的内容,发现了APA表面的特殊结构,从而揭示了APA表面超微结构对半渗透性的重要意义。目前,利用原子力显微镜(AFM)已获得了DNA、透析薄膜、烷烃分子、脂肪酸薄膜以及多糖等的超微结构的图象。

原子力显微镜(AFM)在细胞生物学中的应用

应用原子力显微镜(AFM)可研究活细胞或固定细胞如红细胞、白细胞、细菌、血小板、心肌细胞、活肾上皮细胞及神经胶质细胞的动态行为。原子力显微镜(AFM)对体外动态细胞的分析具有非凡的能力。这些研究大都把样品直接放置在玻片上,不需要染色和固定,样品制备和操作环境相当简单。用免疫胶体金标记细胞膜则打开了细胞表面抗原高分辨定位之门

。原子力显微镜(AFM)细胞成像如:用原子力显微镜(AFM)研究活肾上皮细胞,可在浆膜小斑上以50nm的分辨率观察细胞骨架元素、浆膜浅凹和膜结合丝。用原子力显微镜(AFM)观察血小板的运动,可看到微丝结构、颗粒传输到细胞质外侧及活化中细胞成份的再分配。游走上皮细胞的浆膜可用原子力显微镜(AFM)实时成像。用原子力显微镜(AFM)以50nm的分辨率可观察水中活的或固定的哺乳动物细胞表面骨架结构,在活细胞中可及时跟踪细胞构形的变化,引入药物(秋水仙素)导致的细胞骨架结构表面受体交联(通过IgE抗体与IgE受体结合)等,还可描述细胞骨架力的变化。Parpura等用原子力显微镜(AFM)观察神经元和神经胶质细胞在活体状态下质膜下微丝的运动,由于图像具有直观、实时、动态的特点,从而提出了纳米外科学的概念,即对细胞进行纳米级的人工操作,以达到对病理细胞进行“手术”的目的。 

应用前景原子力显微镜(AFM)技术在生物学领域的应用有赖于样品制备方法和适合针尖-样品相互作用的缓冲液的研究。原子力显微镜(AFM)现已成为一种获得样品表面结构高分辨率图像的有力工具。而更为吸引人的是其观察生化反应过程及生物分子构象变化的能力。因此,原子力显微镜(AFM)在生物学领域中的应用前景毋庸置疑。而对于原子力显微镜(AFM)技术本身,以下几个方面的进展将更加有利于它在生物学中的应用。大多数生物反应过程相当快速,原子力显微镜(AFM)时间分辨率的提高有助于这些过程的观察。生命科学研究有其自身特点,需设计出适合生物学研究的原子力显微镜(AFM)。高分辨率是原子力显微镜(AFM)的优势。其分辨率在理论上能达到原子水平,但目前还没有实现,如何作出更细的针尖将有助于其分辨率的进一步提高。而随着样品制备技术的完善 

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