活性污泥PCR扩增只有二聚体,为什么?

2016-08-19技术资料

来源:转载网络 作者: 小果冻524

活性污泥PCR扩增只有二聚体,为什么?

小妹的分析样品是活性污泥,这学期开始针对V6区做PCR-DGGE,可是一直都是引物二聚体,引物是968GC/1401R,降落PCR,退火是68℃-58℃ 1min,20循环,再68℃ 1min 15循环,退火温度设梯度做还都是二聚体,这学期都要结束了,那个急啊!!小妹对分子生物学实验还是初涉,请各位大侠哥哥姐姐们帮帮忙,感激不尽啊!!
ps.引物是之前师兄去年就用的,是不是放太久不能用了得原因呢??

体系中引物加多了就可能形成二聚体~
引物的话如果在低温下放置的话应该没问题

换个热启动的taq酶试试。我上个月也是这样,热启动后就没问题了.


体系中引物加多了就可能形成二聚体~
引物的话如果在低温下放置的话应该没问题

也设置过不同的引物浓度,还是只有二聚体呢,之前做V3区的都不会这样,不知道为什么了


换个热启动的taq酶试试。我上个月也是这样,热启动后就没问题了.

我们一直用的引物是takara的premix Ex Taq, 刚刚看了一下是LA PCR (Long and Accurate PCR) ,要冷启动。之前V3区都能扩增挺好的,怎么V6不行了呢,我以为换对引物就行了呢,求指点呀!

直接58度退火温度,我之前PCR很好,也是这个引物。引物新配一个,最好把反应体系贴出来看看

可能原因
(1)引物的特异性不好,不能有效的和模板结合,引物自身配对形成引物二聚体;
(2)模板问题:模版浓度过小, 或者引物浓度过高;
(3)Taq酶、Mg2+浓度过高;buffer用钱有完全溶解并混匀!
(4)退火温度适当调整一下


直接58度退火温度,我之前PCR很好,也是这个引物。引物新配一个,最好把反应体系贴出来看看

不用做降落吗?反应体系:premix Ex Taq25ul,DNA模板1ul,上下游引物各1ul,DDH2O 22ul
Premix溶液组成:
TaKaRa Ex Taq 1.25 U/25 μl
dNTP Mixture 2×conc.;各 0.4 mM
Ex Taq Buffer 2×conc.;4 mM Mg2

我这个温度是在别人的文献上得到的,看许多人用这个温度,严格的话应该做降落PCR,但我这边不能做,所以直接上58,结果出来很好。引物10uM 1ul就可以, 模板DNA 你做几个梯度试试。一般1ul足矣。

我也遇到了和您一样的情况,现在很着急,麻烦您的将具体的PCR循环参数贴出了吗?感激不尽!