用clontech的试剂盒做的3'race反转结果有问题

用clontech的试剂盒做的3'race反转，一共做了两个基因，做了一次nest pcr，得到比较单一的条带（600bp左右，kodplus 回收加A），回收连18t测序摇菌测序。其中一个基因A，三个克隆的序列都是一致的，和NCBI的DNA序列也是一样；另一个基因B就有点古怪了，菌液PCR结果有部分条带比回收带小的，当时取了5个测序（3个正常带，2个较小的条带），2个较小的带靠近GSP区200bp是目的序列，后面是来自另一条染色体的序列，3个正常的带结果还算正常，只是它们长度不同。而且有两个疑问：
1、多出来的序列在基因组中能够匹配，但是polyA之前的第一个序列与基因组不匹配，如C应该为T，排除测序问题，送了两个公司测，不同的克隆。
2、根据clontech的引物说明，反转用的引物序列如下所示，polyA有30个，两个基因都没有这么多，A有24个，B的两个测序产物只有14和13，不知道为什么会这样，求解。
3'-RACE CDS Primer A (3'-CDS; 12 µM)
5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30 V N–3'
(N = A, C, G, or T; V = A, G, or C)
附3’引物混合物序列：
10X Universal Primer A Mix (UPM)
Long (0.4 µM):
5'–CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3'
Short (2 µM): 5'–CTAATACGACTCACTATAGGGC–3

用户评论

rioarsenal：

基因B不是有三个正常的么，直接用就行了。那两个比较小的可以暂时不考虑。另外，我记得invitrogen有个race试剂盒，3’5’可以一起出来，比较好用。

楼主恢复：

嗯，谢谢楼上，觉得很奇怪，是不是没有拿到3‘全长，3个正常带中有两个比较短20个bp，另外这个基因的polyA前面的第一个碱基在基因组中总是不匹配。
另外问个5’问题，用的也是clontech的试剂盒，RNA接头连上后反转，试了takara的几个pcr聚合酶，都没有条带，然后换toyobo的kod酶（做3‘时候发现用takara酶的LA也没有条带，后来用kod才出来），两个基因设计8对引物，其中有条带，但是有杂带。二次出来有两条引物条带很亮，但是测序结果都不对，在引物中间的序列乱七八糟，在blast比对后，发现在基因组中有多拷贝，估计是什么组蛋白之类高丰度的mRNA。把产物稀释后做nested pcr，基本没有条带，是不是排除了酶和引物的问题,是5’race没有做好？