双酶切,连接,转化问题,连接不成功还能长这么多的菌?
Zui近做转化,结果很郁闷,跟各位交流一下
我用的载体是一个1300改造后的载体,别人给的,卡那抗性。自己的片段1500bp,是从另一个载体上酶切得到,两端的酶切位点分别是EcoR l 和 Hind lll ,1300载体也用EcoR l 和 Hind lll 酶切后,回收大片段,用Takara 的T4 连接酶 16°C 反应过夜;转化涂板。
现在问题来了,涂平板长的菌都是一片一片的,很难有单菌落。图中是我用了10微升的菌液涂卡那板,结果长成这个样子。我之前做转化从来没有碰到过这种情况,各位虫子有没有什么好的建议?此外,我挑出几个菌斑摇菌,加了卡那抗生素,抽质粒后,再进行双酶切,怎么都得不得2条带,也就是没有我的目的片段,实在是不明白了,连接不成功还能长这么多的菌?哪位高手分析下啊啊啊~
抗生素不管用了
检查下kan是否失效。
强烈建议你换平板,不行的话换感受态
换新的感受态,换新的kan,加的时候培养基温度不要太高
卡纳重新配 估计就是这个浓度出问题了
把感受态找个抗生素平板涂布一下,看看是不是感受态有问题~~~
应该是抗生素不好用了
之前我也遇到过这种情况,长了一满板,而且菌落PCR验证也不对
我是做TA克隆,后来换了新的抗生素,外加蓝白筛选,验证成功了
可能是感受态染杂菌了
我Zui近涂板也总出现类似的问题,后来把菌液稀释了十倍重新涂,还是这个样,请问你的问题解决了吗?到底是什么原因啊?谢谢
抗生素不管用了
检查下kan是否失效。
强烈建议你换平板,不行的话换感受态
换新的感受态,换新的kan,加的时候培养基温度不要太高
卡纳重新配 估计就是这个浓度出问题了
把感受态找个抗生素平板涂布一下,看看是不是感受态有问题~~~
应该是抗生素不好用了
之前我也遇到过这种情况,长了一满板,而且菌落PCR验证也不对
我是做TA克隆,后来换了新的抗生素,外加蓝白筛选,验证成功了
可能是卡那放久了失效或浓度过低或在倒平板时温度过高,还有可能是感受态被污染了,不过可以先通过你原有的质粒大小判断你提取的质粒大小是否正确。可进一步确定问题的所在
像是抗生素失效
嗯,大家都想到了这个问题,我上个月配的,这么快就不管用了吗
现化现用~~
污染,抗生素失效,重新准备材料或者多做对照.
原因找到了!感受态有问题。之前用Amp和奇霉素筛选都没问题,我用Kan 筛选总是做不好,原来感受态细胞有kan抗性 所以我就不幸中枪了~
跟别人要了新的感受态,明天信心满满继续奋斗实验~~~
虽然不一一回复了,但还是再次感谢各位!
上个月刚配的,这么快就失效了吗?一般抗生素在-20°C 能存放多久?
我觉得你应该做个阳性对照和阴性对照,这样能比较好的看出是感觉态的问题还是抗生素的问题,希望你的问题可以尽快解决!
我配的放-20一年以上都没有问题的