双酶切，连接，转化问题，连接不成功还能长这么多的菌？

 

检查下kan是否失效。

 

强烈建议你换平板，不行的话换感受态

 

换新的感受态，换新的kan，加的时候培养基温度不要太高

 

卡纳重新配  估计就是这个浓度出问题了

 

把感受态找个抗生素平板涂布一下，看看是不是感受态有问题~~~

 

应该是抗生素不好用了
之前我也遇到过这种情况，长了一满板，而且菌落PCR验证也不对
我是做TA克隆，后来换了新的抗生素，外加蓝白筛选，验证成功了

 

可能是感受态染杂菌了

 

我Zui近涂板也总出现类似的问题，后来把菌液稀释了十倍重新涂，还是这个样，请问你的问题解决了吗？到底是什么原因啊？谢谢

 

目前还没解决。我个人感觉感受态应该没问题，因为之前一直在用。我决定重新配kan试试

 

可能是卡那放久了失效或浓度过低或在倒平板时温度过高，还有可能是感受态被污染了，不过可以先通过你原有的质粒大小判断你提取的质粒大小是否正确。可进一步确定问题的所在

 

污染,抗生素失效,重新准备材料或者多做对照.

染菌可能性比较大了，还有就是抗生素失效了，一般来说，是不会长着的么多的。

第一个可能像大家说的抗生素出问题了，但是不排除你的载体酶切效果不好。比如有部分载体没有切开，或者部分载体是单酶切，在挖胶回收的时候很难分开，这种情况连接转化往往也会导致长满板，而且都是没有目的片段的空载体。

 

原因找到了！感受态有问题。之前用Amp和奇霉素筛选都没问题，我用Kan 筛选总是做不好，原来感受态细胞有kan抗性  所以我就不幸中枪了~
跟别人要了新的感受态，明天信心满满继续奋斗实验~~~
虽然不一一回复了，但还是再次感谢各位！

 

我觉得你应该做个阳性对照和阴性对照，这样能比较好的看出是感觉态的问题还是抗生素的问题，希望你的问题可以尽快解决！