活性污泥PCR扩增只有二聚体,为什么？

来源:转载网络 作者： 小果冻524

小妹的分析样品是活性污泥，这学期开始针对V6区做PCR-DGGE，可是一直都是引物二聚体，引物是968GC/1401R，降落PCR，退火是68℃-58℃ 1min，20循环，再68℃ 1min 15循环，退火温度设梯度做还都是二聚体，这学期都要结束了，那个急啊！！小妹对分子生物学实验还是初涉，请各位大侠哥哥姐姐们帮帮忙，感激不尽啊！！
ps.引物是之前师兄去年就用的，是不是放太久不能用了得原因呢？？

体系中引物加多了就可能形成二聚体~
引物的话如果在低温下放置的话应该没问题

换个热启动的taq酶试试。我上个月也是这样，热启动后就没问题了.

体系中引物加多了就可能形成二聚体~
引物的话如果在低温下放置的话应该没问题

也设置过不同的引物浓度，还是只有二聚体呢，之前做V3区的都不会这样，不知道为什么了

换个热启动的taq酶试试。我上个月也是这样，热启动后就没问题了.

我们一直用的引物是takara的premix Ex Taq, 刚刚看了一下是LA PCR (Long and Accurate PCR) ，要冷启动。之前V3区都能扩增挺好的，怎么V6不行了呢，我以为换对引物就行了呢，求指点呀！

直接58度退火温度，我之前PCR很好，也是这个引物。引物新配一个，Zui好把反应体系贴出来看看

可能原因
（1）引物的特异性不好，不能有效的和模板结合，引物自身配对形成引物二聚体；
（2）模板问题：模版浓度过小， 或者引物浓度过高；
（3）Taq酶、Mg2+浓度过高；buffer用钱有完全溶解并混匀！
（4）退火温度适当调整一下

直接58度退火温度，我之前PCR很好，也是这个引物。引物新配一个，Zui好把反应体系贴出来看看

不用做降落吗？反应体系：premix Ex Taq25ul，DNA模板1ul，上下游引物各1ul，DDH2O 22ul
Premix溶液组成：
TaKaRa Ex Taq 1.25 U/25 μl
dNTP Mixture 2×conc.；各 0.4 mM
Ex Taq Buffer 2×conc.；4 mM Mg2

我这个温度是在别人的文献上得到的，看许多人用这个温度，严格的话应该做降落PCR，但我这边不能做，所以直接上58，结果出来很好。引物10uM 1ul就可以， 模板DNA 你做几个梯度试试。一般1ul足矣。

我也遇到了和您一样的情况，现在很着急，麻烦您的将具体的PCR循环参数贴出了吗？感激不尽！