有没有比较好的酰胺酶的筛选方法?

2016-09-06技术资料

各位大侠,最近我要构建一个酰胺酶的筛选方法。基因组文库都比较好建立,就是没有一个高效有效的筛选方法,不知有没有谁做过这方面的研究,能否指点一二。
ps:底物为内酰胺,被酶水解后变为氨基酸

你的问题有点模糊,你想通过测定酶活来筛选这个酰胺酶吗?如果是的话,那么可以从底物的变化和生成的氨基酸来检测酶活。前提是底物是有特定紫外吸光值,或将生成的氨基酸衍生化进行荧光检测。一点拙见,还望各位大侠指教。

你可以做一个酶偶联筛选方案,即你的目的酶蛋白将内酰胺水解后生成特定的氨基酸后,再使用该氨基酸特异性催化酶进行反应,生成某种能够产生显色反应或是能与NADH等指示试剂产生反应,就可以进行筛选。
不过筛选方法最重要的稳定性和重复性,即对于同一个蛋白质使用该筛选方法需使CV小于等于10%,否则没有意义。

 

有一个较为常规的方法不知道楼主是否考虑过,采用茚三酮反应来进行筛选,大规模初筛可以通过纸层析或在96孔板上进行。。


用茚三酮显色法我们考虑过,具体是在一个文献上看到的,将构建的基因文库转化涂平板,在用沾有底物的滤纸沾平板上的菌落,使其反应一段时间后再用该滤纸沾用茚三酮湿润的滤纸,但结果是所有的印迹都显色。分析原因是每个菌落中都含有氨基酸,这样做不能排除其他氨基酸的干扰,不知您有什么好的办法排除干扰吗?
 
 
你好,我现在找到了一个针对我的底物和酶活性反应的颜色反应,但是又没有一种快捷的办法筛选出阳性克隆。难道要一个一个挑去单菌落,进行一个一颜色反应,这样做工作量是不是太大了。不知您能否提供一个有效的方法?
 
不好意思,可能之前因为帖子太多的缘故漏掉了你这个回复。
最近在看文献的过程中看到这么一篇Appl Microbiol Biotechnol 的文章
来自于上海华东理工的许建和团队
He Y-C, Ma C-L, Xu J-H, Zhou L (2011) A high-throughput screening strategy for nitrile-hydrolyzing enzymes based on ferric hydroxamate spectrophotometry. Appl Microbiol Biotechnol 89: 817-823.
介绍了一种高通量筛选的较为灵敏 可以排除较多干扰的方法。。你稍微看看是否有参考价值?
另外,建议你可以多查查羧酸特异的颜色反应,这方面文献貌似更多一些,可行性估计也更高。做的人多。

 
我们这边有做文库的还真这么干, 这个工作的价值很大一部分可能就体现在工作量上,当然是在能筛选到较好的克隆的前提下。
有一个博士课题一个一个挑,筛选了上万个克隆。。。

 
 
实验慢慢来吧。开始都很艰难的,因为没接触过。耐着性子做,功到自然成。

 
您在基因文库方面应该很有经验吧,现在老板想让我一个一个挑单菌落去筛选。我想问您几个问题:
1:您说的这个博士筛菌筛了多长时间?最后筛到阳性克隆了吗?因为我现在研二了,怕时间不够,到时候做不完?
2:您们是用96孔板做的吗?
3:我的目标基因片段应该在1500bp左右,回收2-9kb的基因片段可以吗?
4:我是根据酶活筛选的,但是一些根据活性筛选的基因文库的文献中采用puc19做载体,DH5α做宿主,这些不是克隆载体和克隆用的感受态吗?能用来做活性筛选用吗?


您在基因文库方面应该很有经验吧,现在老板想让我一个一个挑单菌落去筛选。我想问您几个问题:
1:您说的这个博士筛菌筛了多长时间?最后筛到阳性克隆了吗?因为我现在研二了,怕时间不够,到时候做不完?
2:您 ...
1 这个博士是我们隔壁实验室的 已经毕业了多年了。他做的酶比较难筛  估计做了一年吧。你是刚进研二 还是 研二已经结束了?时间问题要考虑。
2 是96孔板
3 可以的,最后可以做亚克隆
4 嗯 是的。但是这样还得做一次表达,增加了一倍工作量。

我刚进研二,应该还有一年时间吧。
您说“但是这样还得做一次表达,增加了一倍工作量。“是说用克隆载体做完构建好文库后,还要把片段切下来,连接到表达载体上,导入表达细胞进行表达吗?还是直接加诱导剂就可以表达?
 
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