有没有比较好的酰胺酶的筛选方法？
2016-09-06技术资料
各位大侠，Zui近我要构建一个酰胺酶的筛选方法。基因组文库都比较好建立，就是没有一个高效有效的筛选方法，不知有没有谁做过这方面的研究，能否指点一二。
ps：底物为内酰胺，被酶水解后变为氨基酸
你的问题有点模糊，你想通过测定酶活来筛选这个酰胺酶吗？如果是的话，那么可以从底物的变化和生成的氨基酸来检测酶活。前提是底物是有特定紫外吸光值，或将生成的氨基酸衍生化进行荧光检测。一点拙见，还望各位大侠指教。
你可以做一个酶偶联筛选方案，即你的目的酶蛋白将内酰胺水解后生成特定的氨基酸后，再使用该氨基酸特异性催化酶进行反应，生成某种能够产生显色反应或是能与NADH等指示试剂产生反应，就可以进行筛选。
不过筛选方法Zui重要的稳定性和重复性，即对于同一个蛋白质使用该筛选方法需使CV小于等于10%，否则没有意义。
有一个较为常规的方法不知道楼主是否考虑过，采用茚三酮反应来进行筛选，大规模初筛可以通过纸层析或在96孔板上进行。。
用茚三酮显色法我们考虑过，具体是在一个文献上看到的，将构建的基因文库转化涂平板，在用沾有底物的滤纸沾平板上的菌落，使其反应一段时间后再用该滤纸沾用茚三酮湿润的滤纸，但结果是所有的印迹都显色。分析原因是每个菌落中都含有氨基酸，这样做不能排除其他氨基酸的干扰，不知您有什么好的办法排除干扰吗？
你好，我现在找到了一个针对我的底物和酶活性反应的颜色反应，但是又没有一种快捷的办法筛选出阳性克隆。难道要一个一个挑去单菌落，进行一个一颜色反应，这样做工作量是不是太大了。不知您能否提供一个有效的方法？
不好意思，可能之前因为帖子太多的缘故漏掉了你这个回复。
Zui近在看文献的过程中看到这么一篇Appl Microbiol Biotechnol 的文章
来自于上海华东理工的许建和团队
He Y-C, Ma C-L, Xu J-H, Zhou L (2011) A high-throughput screening strategy for nitrile-hydrolyzing enzymes based on ferric hydroxamate spectrophotometry. Appl Microbiol Biotechnol 89: 817-823.
介绍了一种高通量筛选的较为灵敏 可以排除较多干扰的方法。。你稍微看看是否有参考价值？
另外，建议你可以多查查羧酸特异的颜色反应，这方面文献貌似更多一些，可行性估计也更高。做的人多。
Zui近在看文献的过程中看到这么一篇Appl Microbiol Biotechnol 的文章
来自于上海华东理工的许建和团队
He Y-C, Ma C-L, Xu J-H, Zhou L (2011) A high-throughput screening strategy for nitrile-hydrolyzing enzymes based on ferric hydroxamate spectrophotometry. Appl Microbiol Biotechnol 89: 817-823.
介绍了一种高通量筛选的较为灵敏 可以排除较多干扰的方法。。你稍微看看是否有参考价值？
另外，建议你可以多查查羧酸特异的颜色反应，这方面文献貌似更多一些，可行性估计也更高。做的人多。
我们这边有做文库的还真这么干， 这个工作的价值很大一部分可能就体现在工作量上，当然是在能筛选到较好的克隆的前提下。
有一个博士课题一个一个挑，筛选了上万个克隆。。。
有一个博士课题一个一个挑，筛选了上万个克隆。。。
实验慢慢来吧。开始都很艰难的，因为没接触过。耐着性子做，功到自然成。
您在基因文库方面应该很有经验吧，现在老板想让我一个一个挑单菌落去筛选。我想问您几个问题：
1：您说的这个博士筛菌筛了多长时间？Zui后筛到阳性克隆了吗？因为我现在研二了，怕时间不够，到时候做不完？
2：您们是用96孔板做的吗？
3：我的目标基因片段应该在1500bp左右，回收2-9kb的基因片段可以吗？
4：我是根据酶活筛选的，但是一些根据活性筛选的基因文库的文献中采用puc19做载体，DH5α做宿主，这些不是克隆载体和克隆用的感受态吗？能用来做活性筛选用吗？
您在基因文库方面应该很有经验吧，现在老板想让我一个一个挑单菌落去筛选。我想问您几个问题：
1：您说的这个博士筛菌筛了多长时间？Zui后筛到阳性克隆了吗？因为我现在研二了，怕时间不够，到时候做不完？
2：您 ...
1：您说的这个博士筛菌筛了多长时间？Zui后筛到阳性克隆了吗？因为我现在研二了，怕时间不够，到时候做不完？
2：您们是用96孔板做的吗？
3：我的目标基因片段应该在1500bp左右，回收2-9kb的基因片段可以吗？
4：我是根据酶活筛选的，但是一些根据活性筛选的基因文库的文献中采用puc19做载体，DH5α做宿主，这些不是克隆载体和克隆用的感受态吗？能用来做活性筛选用吗？
您在基因文库方面应该很有经验吧，现在老板想让我一个一个挑单菌落去筛选。我想问您几个问题：
1：您说的这个博士筛菌筛了多长时间？Zui后筛到阳性克隆了吗？因为我现在研二了，怕时间不够，到时候做不完？
2：您 ...
1 这个博士是我们隔壁实验室的 已经毕业了多年了。他做的酶比较难筛 估计做了一年吧。你是刚进研二 还是 研二已经结束了？时间问题要考虑。
2 是96孔板
3 可以的，Zui后可以做亚克隆
4 嗯 是的。但是这样还得做一次表达，增加了一倍工作量。
2 是96孔板
3 可以的，Zui后可以做亚克隆
4 嗯 是的。但是这样还得做一次表达，增加了一倍工作量。
我刚进研二，应该还有一年时间吧。
您说“但是这样还得做一次表达，增加了一倍工作量。“是说用克隆载体做完构建好文库后，还要把片段切下来，连接到表达载体上，导入表达细胞进行表达吗？还是直接加诱导剂就可以表达？
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